小鼠单抗腹水的制备方法以及佐剂在腹水制备中的应用

1975 年，Kohler和Milstein发表了“分泌预定特异性抗体融合细胞的持续培养”的著名论文，具有划时代意义的新技术：单克隆抗体(McAb)技术从此问世。各种用途的单克隆抗体可用不同的方法获得，包括小鼠单抗腹水制备或通过各种杂交瘤细胞培养系统在体外生产。如下图：

 小鼠腹水制备单抗是一种操作简便、经济的常用方法，主要用于生产科研或诊断用的单克隆抗体，是一般用途的单克隆抗体制备的方法。腹水中的单克隆抗体的浓度可达5~20mg/ml，是体外培养法的100~1000倍左右，是目前常使用的方法。

小鼠单抗腹水技术是通过将杂交瘤细胞接种至BALB/c小鼠腹腔内，利用其腹腔作为天然生物反应器，促使细胞增殖并分泌单克隆抗体的方法。产量高，经济成本低，无需复杂设备，抗体在生理微环境中分泌，折叠正确且糖基化完整，活性更接近天然抗体。腹水制备单抗可以支持难培养细胞株。

1. 选择免疫动物

在制备小鼠单克隆抗体腹水时，动物的选择很重要，‌BALB/c小鼠为常用品系，因其与大多数杂交瘤细胞具有遗传相容性，BALB/c小鼠1923年育成，毛色为白色，BALB/c小鼠形成了许多亚系，如BALB/cAnN，BALB/cJ和BALB/cCd。乳腺癌发病率低，但对致癌因子敏感，血压较高，多有心脏损害，两性常有动脉硬化，对放射线极度敏感。常用于单克隆抗体和免疫学研究。BALB/c小鼠生产性能好，繁殖期长，一般无相互侵袭习性，比较容易群养。

优选8～12周龄成年鼠，体重需达18～20g以保证腹腔容量。老年鼠（如10月龄以上）会因代谢减缓而会影响腹水产量。雌性小鼠较常使用，因其腹腔空间较大且攻击性较低。

2. 处理动物

通过目测和体重监测筛选健康个体，对小鼠进行病原体检测，排除鼠痘病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒等病原体感染，实验前需进行7天环境适应，观察进食、排泄及活动状态。在腹腔注射杂交瘤细胞之前，需先用石蜡油、降植烷或小鼠单抗腹水制备专用佐剂先处理小鼠，腹腔注射，0.5mL/只小鼠，处理腹腔15天左右，一般12～18天的预处理期，期间监测小鼠健康状态。小鼠单抗腹水制备专用佐剂预处理小鼠腹腔，可引发腹腔内轻度炎症反应，促进巨噬细胞和成纤维细胞聚集，形成富含营养的微环境，这种环境更有利于杂交瘤细胞定植并持续分泌抗体。佐剂在腹腔内形成油性基质，延缓杂交瘤细胞被免疫系统快速清除，从而延长细胞存活时间，增加抗体积累量，预处理后的小鼠腹腔能支持杂交瘤细胞高效增殖，产生的腹水量可达到未处理小鼠的1.5～2倍，同时抗体效价显著提升。佐剂预处理后可降低腹腔内原有细胞成分的干扰，使后续离心纯化时更容易分离出高纯度抗体。实验室有条件的情况下，建议用小鼠单抗腹水制备专用佐剂制备小鼠单抗腹水。

疫动物

小鼠单抗腹水制备专用佐剂预处理完小鼠腹腔后，注射杂交瘤细胞，建议每只注射80万～100万个。腹水会比普通佐剂晚出1.5天～2天，但通常情况下相同细胞株腹水的量是普通方法产出量的1.5倍左右，个别细胞株能到2倍以上且单抗腹水效价一般保持不变，相当于抗体产量增加50%-100%。

4. 收获腹水

用一只手抓取并固定小鼠，绷紧腹部皮肤，另一只收将针头刺入腹腔1～2cm，针头刺入时应西安则左下腹或右下腹，避开上腹部的重要脏器和腹中线的大血管。抽取腹水。若操作中出现问题，可以参考以下解决办法：

（1）若小鼠有大量的腹水但是无法流出，可以将针头缓慢地旋转，或换一个位置插入。

（2）若没有腹水积蓄且小鼠的健康状况尚好，可以重新注射细胞。

（3）若没有腹水积蓄且小鼠死亡(尤其是在注射后2周内发生死亡)，下次注射时减少细胞的量。

（4）若形成了实体的肿瘤，将肿瘤细胞打散、重悬，并用以注射另一只小鼠单抗腹水制备专用佐剂预处理的小鼠。

（5）若只形成了少量的腹水，将其注射另一只预处理的小鼠（约0.5mL/只）。

（6）室温下，1500g离心腹水10min。若液体在离心管内凝结，在离心前用细木棒在凝块与离心管壁间刮一圈，若凝块附在木棒上则将其丢弃，否则不做处理，离心后凝块将成为沉淀的部分。

（7）取上清，弃沉淀。在所有腹水收集完之前将先离心得到的腹水保存于4℃(不超过1周)。

5. 检测腹水效价

  可用ELISA法检测腹水效价。

补充：小鼠抓握的方法

小鼠通常比较温顺，但被激怒后也会咬人。正确的操作会让它们更加温顺。

（1）用手温柔地抓住小鼠的尾巴，将其从笼中取出。将动物放置在笼盖的栅栏上，向后轻微的牵拉尾巴。避免用噪声和猛烈动作激怒动物。如下图：

（2）用另一只手的拇指和食指从后颈部抓住耳后皮肤。将尾巴从优势手移出来，用另一只手的小指压住。

（3）观察或注射动物。