小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定ELISA试剂盒原理及应用

一、小鼠单克隆抗体及用途

1、什么是单克隆抗体

在动物体内，抗体主要由浆细胞合成，浆细胞是一种终末分化的B淋巴细胞，因为浆细胞不能在组织培养中生长，所以不能用作体外抗体的来源，Köhler 和Milstein在1975年开发了一种技术，该技术可以使分泌具有明确特异性的抗体的细胞克隆群生长。从免疫动物中分离出的抗体分泌细胞与骨髓瘤细胞(一种B细胞肿瘤)融合。这些杂交瘤细胞可以在体外维持生长，并持续分泌具有特定特异性的抗体。由杂交瘤产生的抗体被称为单克隆抗体。

2、为什么选择小鼠作为单抗来源

常用于制备单克隆抗体的实验动物包括小鼠、大鼠、亚美尼亚仓鼠和兔。其中常用的免疫接种对象是小鼠，来自BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞是良好的融合细胞，绝大多数单克隆抗体来源于小鼠细胞，小鼠易于获得遗传背景一致的近交系品种、饲养成本低、易操作；其次，有很多试剂可用于检测小鼠免疫球蛋白；另外，小鼠对外来蛋白质能产生良好的免疫应答，致敏淋巴细胞与多种鼠源骨髓瘤细胞系能够发生有效融合。

3、小鼠单克隆抗体的特点

小鼠单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的均一性抗体，其核心特性在于能够高特异性识别并结合特定抗原表位，且同一批次抗体分子结构完全一致，呈现出纳摩尔级高亲和力。然而，小鼠单克隆抗体的高度特异性也导致其易受抗原表位变异影响而失效，且传统杂交瘤技术需经历数月的细胞培养、克隆筛选及验证流程，成本高昂且技术门槛较高，阻碍了其在快速突变病原体或复杂表位靶点中的应用广度。

    多克隆抗体                                      单克隆抗体

4、小鼠单克隆抗体的用途

小鼠单克隆抗体是强大的免疫化学工具，已成为在生物医学及工业领域应用广泛、较有价值的生物大分子。杂交瘤技术的发明及单克隆抗体的生产为科研工作带来了很大的改变，为其提供了无限量的、独特的单克隆抗体试剂，用于特异性抗原的识别、分离、清除、活化或检测等。

二、小鼠单克隆抗体Ig类、亚类、κ型和λ型

1. 小鼠单克隆抗体Ig类：依据重链C区的理化特性及抗原性的差异，小鼠单抗Ig类可分为IgG，IgM，IgA，IgE和IgD 五大类，重链分别为γ，μ，α，ε，δ，重链决定免疫球蛋白的种类。

2. 小鼠单克隆抗体Ig亚类：亚类是根据重链恒定区的微细结构、二硫键的位置与数目及抗原特性的不同进行区分的。小鼠的IgG有IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3 四个亚类，小鼠IgA、小鼠IgM、小鼠IgE和小鼠IgD未发现亚类。

3. 小鼠单克隆抗体Ig的κ（Kappa）型和λ（Lambda）型：根据轻链恒定区的抗原性不同，小鼠单克隆抗体Ig的轻链分为κ（Kappa）和λ（Lambda）两个型。任何种类的免疫球蛋白均有两型轻链分子。

三、为什么要对小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定

目前，杂交瘤单克隆抗体技术的应用日益广泛和深入。小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型的鉴定对McAb的进一步研究具有十分重要的意义。

单克隆抗体的不同类/亚类/亚型在结构上有所区别，其免疫源性与在体内发挥的作用存在差异，在生物体内具有不同的功能效应，因此在筛选杂交瘤时需要确定高表达量的阳性克隆是否是所需要的类/亚类/亚型分子，而且，明确抗体的类/亚类/亚型有助于选择更加合适的抗体纯化方法，能够大大提高抗体获得率，对抗体进行进一步的细分，并进行抗体类/亚类/亚型鉴定，对于疾病作用机理的研究和抗体药物的开发，均有重要意义。

不同类/亚类/亚型抗体在抗体结构（例如Fc区结构、是否以多聚体形式存在等）及功能上（例如补体激活、半衰期等）也有所区别，进行抗体亚型鉴定能够更加清楚的了解手中抗体的结构及功能，从而更好的应用于下游实验。

四、小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定的方法

小鼠单克隆抗体 Ig 类/亚类/亚型的鉴定方法多样，涵盖血清学方法、免疫电泳、ELISA 、胶体金以及分子生物学方法等。在这些方法里，ELISA 鉴定法较为常用。该法灵敏度较高，即便是极微量的单克隆抗体也能够精准检测出来。操作相对标准化，易于实现自动化流程，十分契合大量样本的快速检测需求。检测结果可借助仪器精确读取数据，进而开展定量分析，所获数据客观可靠，能够为研究和应用提供坚实有力的支持 。

五、小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定ELISA试剂盒原理

小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定ELISA试剂盒利用双抗体夹心法鉴定小鼠淋巴细胞杂交瘤培养上清中单克隆抗体或特异亲和纯化单克隆抗体的类和亚类（可区分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA\Kappa\Lambda）。采用小鼠抗体共有位点的二抗包被微孔板，与加入的培养上清中的小鼠抗体结合，再加入HRP标记的抗小鼠各类、亚类、亚型的抗体来分别反应， 随后用TMB底物系统显色并用稀硫酸终止，再通过酶标仪检测吸光度来判断被测单克隆抗体的类或亚类。ELISA试剂盒具有极高的分辨率，是鉴定小鼠单克隆抗体类、亚类、亚型的可靠工具。

 双抗体夹心法（Ab，抗体；Ag，抗原（小鼠抗体）；E，酶）

六、小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定ELISA试剂盒鉴定步骤

 1、先将试剂盒恢复室温（大约30分），然后用纯水把清洗液配成工作浓度（一份浓缩清洗液加19份纯水）。

 2、取出酶标板。每个标本需要8孔，阳性对照8孔，阴性对照8孔。多余的用自封袋保存，记得放入干燥剂。

 3、将标本检测孔每孔先加入标本稀释液各50μl。然后将50μl细胞培养上清（或特异亲和纯化的抗体）再加入酶标微孔板，每个标本加8孔；阳性对照和阴性对照各8孔每孔100μl此处不加标本稀释液。贴上封板膜37℃温育30分钟。

 4、弃去板内液体，手工洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干（或机洗5遍）。再在每个标本的8孔中分别加入8种酶标二抗各100μl，通用阳性、阴性对照的各孔也一样。在加样图上或酶标板上做好标记。贴上封板膜37℃温育30分钟。

 5、吸弃板内液体，手工洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干（或机洗5遍）。每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50μl，换一张新的封板膜贴板避光37℃显色20分钟。

 6、本试剂盒特异性好一般肉眼即可观察出结果，看显色蓝的那个孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类。更可将反应终止液（每孔50μl）终止反应后用酶标仪450nm测定波长，630nm参考波长双波长测定结果，参看高值孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类亚型(阳性对照OD一般不小于0.8，阴性对照一般不高于0.15，阳性判定标准：样品OD大于阴性OD+0.15，阴性OD低于0.05按0.05算)。

七、试剂盒的选择

1. 如果不需要对小鼠单克隆抗体Ig 的κ（Kappa）型和λ（Lambda）型进行鉴定，可以选择小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定试剂盒鉴定，鉴定步骤同上。如果同时需要对小鼠单克隆抗体Ig 的κ（Kappa）型和λ（Lambda）型进行鉴定，则应选择小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定ELISA试剂盒进行鉴定。

2. 小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定试剂盒、小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定试剂盒主要用于小鼠淋巴细胞杂交瘤培养上清中单克隆抗体或特异亲和纯化单克隆抗体的类、亚类、亚型的鉴别。

3. 在检测腹水类单抗时要稀释到1/5万，虽然小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定试剂盒、小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定试剂盒也能分辨，但是由于此类样品成分十分复杂，有干扰结果的可能，这种情况下建议选择小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定酶标二抗即用套装进行鉴定。同时也可以使用抗原包被板替换试剂盒内的包被板来解决此类问题，但这种情况下阳性对照不显色属于正常。

4. 选择小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定酶标二抗即用套装进行鉴定时，很多试剂是需要自己准备的，如果感觉麻烦，可选择小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定试剂盒进行鉴定。将会带来非常满意的试验结果。

八、注意事项

1. 手洗板子时一定要把孔加满，停留10秒然后弃尽，甩干净。特别是在酶标二抗温育后洗板时一定要把酶吸出而不是甩出，要吸净。这个在手工洗板时对结果很重要。

2. 一次没用完的板子要带干燥剂放自封袋封好，随盒存放。

3. 拿放板子时不要剧烈抖动，以免孔间交叉污染出现错误结果。

4. 本试剂一般不会出现两个阳性，但出现两个阳性的现象现实中是真实存在的，一般会一个OD很高，另一个很低但却还能判为阳性，实验分析表明这种情况下以OD高值孔为准，出现这种情况有多重原因：A、培养的细胞中有“饲养细胞”残留；B、由于单抗研制存在人工干预步骤因此抗体本身有可能会存在亚类结构上的轻微变异； C、样品为非特异亲和纯化的抗体或样品是腹水；D、上清出现少量污染；E、实验操作粗放；F、加错试剂。

5. 在使用小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定酶标二抗即用套装鉴定时，过于在强光或不良环境中频繁开启管盖有可能因此使效期缩短，显色必须使用TMB系统。